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　　深海是一個(gè)由高壓和低溫組成的極端環(huán)境，并存在熱液、冷泉、泥火山、鹽鹵池等各種特殊生境。由于光線(xiàn)無(wú)法到達，深海生態(tài)系統被稱(chēng)為為以化能自養微生物為生命基礎的“暗世界”?；谏詈Ｉ飳W(xué)研究在揭示生命起源與演化機制、解析全球碳氮元素循環(huán)過(guò)程以及尋找新的天然活性產(chǎn)物和工程酶類(lèi)方面的重要意義和價(jià)值，越來(lái)越多科學(xué)研究人員將目光投向深海，并開(kāi)展了一系列前沿性的深海探索項目。 

　　作為海洋中最高豐度和生物量的生命形態(tài)，海洋微生物在碳、氮、硫等關(guān)鍵元素循環(huán)方面發(fā)揮重要作用，是生物地球化學(xué)循環(huán)過(guò)程中最重要的一員，因而成為海洋前沿科學(xué)研究的主要專(zhuān)注點(diǎn)之一。然而，受限于微生物培養技術(shù)條件的不足，實(shí)驗室可培養的微生物種類(lèi)非常有限，由于受壓力、溫度、原位物質(zhì)能量特征等因素的影響深海來(lái)源的微生物更是難以培養。因此，對微生物的研究極度需要非培養依賴(lài)性的技術(shù)手段。目前，利用DGGE電泳、16S rRNA文庫以及454焦磷酸法測序等手段，研究人員已對環(huán)境微生物的群落結構有了比較深入的認識。近年來(lái)高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展更讓科學(xué)家們得以從宏基因組學(xué)和宏轉錄組學(xué)水平解析環(huán)境微生物的功能特征。宏基因組學(xué)是從DNA水平上對環(huán)境微生物所攜帶的功能特征基因進(jìn)行分析。宏轉錄組學(xué)則是從RNA水平上反應微生物的原位基因表達情況，可以更真實(shí)的揭示環(huán)境微生物的活性狀態(tài)，日漸成為環(huán)境微生物學(xué)研究的發(fā)展趨勢。 

　　相對于DNA分子，RNA非常易于降解，其半衰期一般僅有幾分鐘(Steglich et al., 2010)，這對如何獲取真實(shí)反映微生物原位表達活性的轉錄組數據構成極大挑戰。對于深海微生物取樣而言，常規手段是通過(guò)Niskin取樣瓶采集海水樣品，將樣品收回到船上后進(jìn)行過(guò)濾收集和固定處理，這種取樣方式存在諸多不足，從深海取樣采集到回收至甲板上一般需耗時(shí)幾十分鐘至數小時(shí)不等，樣品回收過(guò)程中壓力、溫度，及溶氧量等諸多環(huán)境因素的變化，將影響微生物的活性狀態(tài)，致使獲取的深海微生物樣品無(wú)法真實(shí)反應其深海原位的基因表達情況。采用合適的裝備，對深海樣品進(jìn)行原位富集過(guò)濾，并進(jìn)行原位固定取樣成為解決這一問(wèn)題的關(guān)鍵。 

　　在深海原位微生物取樣技術(shù)方面，國外目前已經(jīng)開(kāi)展了相關(guān)的研發(fā)工作。其中，美國伍茲霍爾海洋研究所(WHOI)研發(fā)了擁有多個(gè)采樣瓶的序列生物水體采樣裝置，可根據科學(xué)需求選擇采集水體樣本或是微生物樣品，并能攜帶固定液完成樣品的原位固定，實(shí)現原位樣品序列采集功能。該實(shí)驗裝置已在大西洋中脊實(shí)驗航次中，搭載于ROV深潛器進(jìn)行了驗證性實(shí)驗(Breier et al., 2009)。2014年，該裝置進(jìn)行了系統升級，升級后的SUPR-V2系統功能更加全面(Breier et al., 2014)。Wurzbacher等人也設計開(kāi)發(fā)了相對簡(jiǎn)單的原位過(guò)濾固定取樣器(in situ filtration and fixation sampler, IFFS)，用于分析水體中放線(xiàn)菌actR基因的原位表達情況。該裝置配載脈沖觸發(fā)裝置，可在過(guò)濾給定體積的水樣后(設計水樣過(guò)慮體積為100ml-900ml) ，切換至固定液導管，實(shí)現對樣品的原位固定(Wurzbacher et al., 2012)。Sanders等人則設計了原位生物組織勻漿固定取樣器(in situ Mussel And Snail Homogenizer, ISMASH)，通過(guò)搭載ROV深潛器，借助ROV機械手抓取熱液區蝸牛后，可在海底放入該裝置，進(jìn)行原位的生物組織勻漿及樣品保存，用于解析熱液區貝類(lèi)和螺類(lèi)共生菌的轉錄組與共生機制(Sanders et al., 2013)。此外， McLane實(shí)驗室作為一家專(zhuān)業(yè)科技公司（www.mclanelabs.com），服務(wù)于海洋科學(xué)研究，也根據客戶(hù)需要量身設計了一系列的海洋水體取樣裝置，并且部分裝置可搭載深海著(zhù)陸器使用。不過(guò)，該公司的產(chǎn)品功能相對固化，對于特定需求(諸如高壓力耐受性)需對裝置做重新的設計調整。相對而言，國內對深海生物研究的起步較晚，技術(shù)積累相對缺乏。 

　　因應深?？茖W(xué)研究的需求，中國科學(xué)院深?？茖W(xué)與技術(shù)研究所的科學(xué)及工程技術(shù)人員通力合作，設計了一套依托于著(zhù)陸器的自動(dòng)化深海微生物原位富集與固定取樣器(ISMIFF)。該取樣器是一套可在深海及深淵環(huán)境(深度大于6000的深海海域)下進(jìn)行水體微生物原位富集過(guò)濾并將其生物信息即時(shí)固定的裝置。本裝置主要由控制艙和過(guò)濾艙兩個(gè)艙體組成。其中，控制艙是一個(gè)充油補償艙，包含控制電路板、泵、閥以及壓力傳感器等，過(guò)濾艙則主要用于放置生物濾膜。該裝置搭載于著(zhù)陸器進(jìn)行作業(yè)，由著(zhù)陸器提供能源，并通過(guò)串口與著(zhù)陸器進(jìn)行通訊。 

　　ISMIFF的作業(yè)流程圖1所示。作業(yè)開(kāi)始前，需將裝置內的管路清洗并充滿(mǎn)無(wú)菌水。著(zhù)陸器坐底后，為避開(kāi)浮塵影響，延時(shí)0.5-2小時(shí)后向富集裝置發(fā)送運行指令，富集裝置控制泵開(kāi)始運轉，將海水泵入含有0.22 μm生物濾膜(用于截留微生物)的過(guò)濾艙中。裝置內的壓力傳感器實(shí)時(shí)監控過(guò)濾管路中的液體壓力，根據壓力反饋控制泵的輸出功率，從而使管路中液體壓力保持在合理范圍。當富集裝置過(guò)濾海水體積達到預設置后，通過(guò)電磁閥切換試劑管路，將固定液注入過(guò)濾艙，以實(shí)現樣品原位固定。著(zhù)陸器回收后，立即在實(shí)驗室進(jìn)行濾膜樣品的處理與保存。 

圖1. 深海微生物原位富集與固定取樣器及作業(yè)流程圖  

　　ISMIFF可最大程度實(shí)現原位保真取樣。該取樣器在過(guò)濾水體總量方面也具有明顯優(yōu)勢，濾水初始流速高達700 ml/min，實(shí)際測試中7小時(shí)內完成約300L海水的原位過(guò)濾，遠大于船載CTD采水器一次下作業(yè)的采水量240L，為在深海及深淵寡營(yíng)養環(huán)境低豐度微生物樣品的獲取提供了便利。ISMIFF已完成121MPa(1萬(wàn)米海水深度1.2倍的壓力值)的嚴格打壓測試，可實(shí)現全海深原位取樣，極大的擴展了裝置的應用范圍。 

　　ISMIFF首先在中國科學(xué)院深?？茖W(xué)與工程研究所所執行的馬里亞納深淵科考航次中進(jìn)行了實(shí)驗性應用?？茖W(xué)家們采集了挑戰者深淵序列深度的水體微生物原位樣品，通過(guò)宏基因組測序對深淵原位條件下的水體微生物群落組成進(jìn)行了解析，結果表明原位條件下的微生物群落組成與常規Niskin采水瓶采集的樣品有很大差異(Wang et al. 2019)?；谛碌幕蚪M分揀技術(shù)，研究人員亦成功獲取了30個(gè)深淵微生物類(lèi)群的高質(zhì)量基因組序列，闡明了與氮硫相關(guān)的元素循環(huán)過(guò)程和轉錄活性特征，并重點(diǎn)闡釋了Chloroflexi和Marinimicrobia分別在深淵難降解型有機物和蛋白類(lèi)有機物的代謝方面所發(fā)揮的重要作用(圖2；Gao et al. 2019)。該研究是中國科學(xué)家首次對深淵微生物基因組進(jìn)行較為全面的解析并對其原位代謝活性進(jìn)行了詳盡的報道，揭示出深淵特殊極端環(huán)境對微生物種群分化的驅動(dòng)作用。另外，此研究還表明深淵特定微生物類(lèi)群可能通過(guò)氧化CO來(lái)獲取能量，拓展了CO氧化菌的已知生存空間范圍(Gao et al. 2019)。 

圖2.  深淵水體微生物生態(tài)角色全面解析 

　　在國家重點(diǎn)研發(fā)計劃專(zhuān)項課題“冷泉系統生物演化及適應機制”(課題編號2018YFC0310005)的支持下，ISMIFF在海底冷泉微生物原位取樣方面也實(shí)現了突破。在2019年5月及2020年5月廣州海洋地質(zhì)調查局“海洋地質(zhì)六號”科考船的南海冷泉航次中，ISMIFF搭載“海馬”號ROV，于海馬冷泉區不同站位開(kāi)展了底棲生物幼蟲(chóng)及水體微生物的富集和原位固定取樣（圖3）。在2021年1月，由中國科學(xué)院深?？茖W(xué)與工程研究所“探索二號”船執行的海南科考航次中，科學(xué)家們借助“深海勇士”號載人潛水器將ISMIFF直接布放海底，成功進(jìn)行了多位點(diǎn)的原位固定取樣（圖4）。應用ISMIFF進(jìn)行海底采樣不僅能夠大幅增加過(guò)濾水體的體積，減少工作量，而且可以實(shí)現樣品原位固定，可以更好的服務(wù)于深海冷泉生態(tài)系統的科學(xué)研究。 

圖3. ISMIFF原位取樣器借助“海馬”號ROV在進(jìn)行海底原位取樣 

圖4. ISMIFF原位取樣器直接布放于海底冷泉區進(jìn)行原位取樣 

　　相關(guān)閱讀： 

　　Breier JA, Rauch CG, McCartney K, Toner BM, Fakra SC, et al. (2009). A suspended-particle rosette multi-sampler for discrete biogeochemical sampling in low-particle-density waters. Deep-Sea Res PT I, 56: 1579-1589.  

　　Breier JA, Sheik CS, Gomez-Ibanez D, Sayre-McCord RT, Sanger R (2014). A large volume particulate and water multi-sampler with in situ preservation for microbial and biogeochemical studies. Deep-Sea Res PT I, 94: 195-206. 

　　Gao ZM, Huang JM, Cui GJ, Li WL, Li J, Wei ZF, et al (2019). In situ meta-omic insights into the community compositions and ecological roles of hadal microbes in the Mariana Trench. Environ Microbiol, 21: 4092-4108. 

　　Wurzbacher C, Salka I, Grossart HP. (2012). Environmental actinorhodopsin expression revealed by a new in situ filtration and fixation sampler. Environ Microbiol Rep, 4: 491-497. 

　　Wang Y, Gao ZM, Li J, He LS, Cui G, et al. (2019). Hadal water sampling by in situ microbial filtration and fixation (ISMIFF) apparatus. Deep-Sea Res PT I, 144: 132-137. 

　　Sanders JG, Beinart RA, Stewart FJ, Delong EF, Girguis PR. (2013). Metatranscriptomics reveal differences in in situ energy and nitrogen metabolism among hydrothermal vent snail symbionts. ISME J, 7: 1556-1567.